15 серпня 1556 року у Свято-Троїцькому монастирі (нині місто Ізяслав Хмельницької області) розпочали роботу над Євангелієм, а завершили 29 серпня 1561 року в Пересопницькому монастирі (тепер Рівненський район Рівненської обл.).

Пересопницьке Євангеліє – непересічне явище в українській національній культурі. Про це протягом XIX століття захоплено і одностайно говорили всі без винятку дослідники.

Замовила книгу волинська княгиня Анастасія Юріївна Заславська (в дівоцтві Гольшанська-Дубровицька), дочка київського воєводи Юрія Івановича Гольшанського, що вийшла заміж за князя Кузьму Івановича Заславського з роду князів Острозьких.

Вперше оригінал пам'ятки у 1837 році виявив у бібліотеці Переяславської духовної семінарії видатний український мовознавець і археограф О. М. Бодянський. Він же ввів його в науковий обіг, опублікувавши інформаційну статтю про нього в «Журнале Министерства народного просвещения». Описуючи унікальну реліквію, вчений зазначав: «Це Євангеліє важливе, по-перше, як єдиний пам'ятник перекладу чотирьох Благовістів на південно-руську (малоросійську, українську, русинську) мову. До сих пір ми не знали, що малоросіяни (в широкому сенсі), маючи з іншими слов'янами грецького сповідання Св. Писання давньо-слов'янською, церковно-книжною мовою, давно вже намагалися перевести його, для більшого усвідомлення і поняття, на свою живу, розмовну, загальнонародну мову. <...> мова цього Євангелія — чисто південно-руська, переважно русинська, якою говорять в колишній Червеній (Червленій, Червоній), нині Галицькій Русі, з невеликою домішкою церковно-книжкових слів, від яких перекладач не в силах був відступити, переводячи зі спорідненого наріччя, вважаючи їх більше відповідними важливості самого предмета, більше виразними і так би вже освяченими».

Цікаво, що приятель Бодянського Т. Г. Шевченко, будучи співробітником Київської археографічної комісії, наприкінці 1845 року отримав від неї завдання з дослідження пам'яток старовини. Виконуючи це завдання, Шевченко зацікавився старовинними книгами, які перебували у бібліотеці Переяславської семінарії. Серед них було і Пересопницьке Євангеліє, мова якого не викликала у Кобзаря жодних сумнівів. «У скромній семінарській бібліотеці зберігається два Євангелія ... – пише він у своїх нотатках. — Друге Євангеліє, також на пергаменті, витонченіше і розкішніше першого, писано малоросійським наріччям, з написом на краях перших листів...».

Український мовознавець П. І. Житецький також не сумнівався у належності мови Пересопницького Євангелія. У своїй капітальній праці «Очерк звуковой истории малорусского наречия» (1878 р.) він вмістив уривки з цієї пам'ятки як зразки «писемної мови з ознаками малоросійського наріччя». До вивчення цієї унікальної пам'ятки вчений неодноразово звертався і в подальшому. У лекції, прочитаній в колегії Павла Галагана в Києві у 1882 році, підкреслюючи багатство пам'ятника та його значення для вивчення української мови, Житецький із захопленням говорив: «В кінці п'ятдесятих років XVI ст. в Пересопницькому монастирі на Волині працювали над перекладом Євангелія „з мови болгарської на мову руську“ архімандрит Григорій та якийсь Михайло, син протопопа Сяноцького. Пересопницькі перекладачі внесли в свою працю південно-руську фразеологію в такому достатку, що з неї однієї можна було б вибрати багатий матеріал для південно-руської граматики XVI ст.».

Справді, суто українськими є слова «на початку», «ся стали», «обыймет», «речи» (в значенні «вещи»), «ништо» (яке вимовляється як «ніщо»), зворот «через Него» (а не «из-за Него»).

Весь текст Пересопницького Євангелія рясніє тлумаченнями церковнослов'янських слів, зробленими живою староукраїнською мовою, так званими глосами, виділеними у рамку безпосередньо в самому тексті або на полях рукопису: «Был же там колодязь Ѩковль [студня або криниця]»; «И рекл так: учиню, размечу житницу мою [клуню або стодолу]». З цієї точки зору переклад, як і вся книга в цілому, представляє величезний інтерес для лінгвістів.

В Євангелії є й оригінальні тексти укладачів (архімандрита Пересопницького монастиря Григорія та писаря Михайла Василієвича з Сянока), які не є перекладами канонічних текстів і мова яких не викликає жодних сумнівів. Ось найбільш відомий уривок з післямови: «Юж за помочоу Божіею маешь всѣ зоуплъна выписаныи книгы четырех евангелистовъ, выложеныи изъ языка блъгарского на мову роускоую читачоу милыи».

Сьогодні оригінал Пересопницького Євангелія зберігається в Інституті рукописів Національної бібліотеки України ім. Вернадського НАН України. У 2001 році Національною бібліотекою України та Інститутом української мови було здійснено наукове видання цієї видатної пам'ятки.

Починаючи з 1991 року, стало традицією під час присяги Президента України на вірність народові України поряд з Конституцією України та Актом проголошення незалежності України класти Пересопницьке Євангеліє як найдорожчу духовну святиню.